色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类。多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、U形管等形状。液相色谱通常均采用填充柱。色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相，以及色谱柱的制备和操作条件。
1.网上对柱子是否可以反冲一直有争论，那什么样的柱子可以反冲，什么不可以。反冲后是正着用，还是反着用。具体到各型号柱子不仅是ODS柱，其他如，正向柱、氨基柱、离子交换柱等。
答：一般的正相反相柱应该都能反冲，只有两端筛板孔径不对称的柱子不能反冲，不过目前这样的柱子已经比较少见了。反冲是为了把柱头的污染物冲洗掉，反冲后还是正着用比较好，以免柱子的两头都被污染，提倡：正向使用，反向冲洗。
2.对于一根常用的C18柱，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？
答：新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为，分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是：将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。
3.氨基柱在进酸性样品时，很伤柱子，如使用一段时间后，柱效降低，峰形改变，如何恢复？
答：氨基柱测酸性样品，应该是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能会使略带负电荷的氨基官能团质子化，导致使用一段时间后对于某些类的分析物保留性质有所改变或表现在柱效下降。建议：用5～10倍的柱体积的含0.5～1.0％NH3的乙腈-水(50：50)溶液冲洗该柱（冲洗后当然要再用不含碱的流动相洗去多余氨），之后，再进行分析这类酸性分析物时建议在流动相中略微添加少许氨如，0.1％。
4.柱子在什么情况下可以清洗一下筛板呢？原来也讨论过这个问题，有人也拆下来清洗过，但看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮，然后把清洗好的筛板安装上去。问题解决了，但使用寿命会不会减少呢？
答：柱头污染了，就取出污染的，再装一些填料。因为，假如你刮了些填料，那么微观的塔板数就少了。假如你刮得不多，仅表面，可能就是一些脏物，所以，问题解决，但是，今后还会有同样问题，影响柱效。建议还是装一个预柱。
5.如果柱子取下来放置一段时间，需要做什么保护吗？
答：对一般的反相柱，洗干净后放到纯甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵头塞紧柱两头，以免保存溶剂挥发，应该不需要做特殊的保护。
6.流动相中加入适量的四氢呋喃可以改善峰形的机理是什么？
答：甲醇为质子给予体、乙腈为质子接受体、四氢呋喃是偶极溶剂，应该除了极性影响，还有另外的影响因素，至于分离机理，还是比较复杂的，不能看成是个万能方法。
7.预柱或保护柱用还是不用的问题？
答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接得好并且尽量控制其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择添加预柱（中间是个筛板），制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还是***好配个保护柱。
8.想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法，是不连检测器吗？
答：反冲就是将柱子反向连到系统中。因为，有污染物反冲出来，当然不连检测器，出液端直接接到废液瓶就可以。
9.waters，AtlantisC18柱可以用较高比例的流动相，那么用完后应该怎么清洗？在什么体系中保存比较合适？
答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：
流动相中不含缓冲盐：分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min
流动相中含有缓冲盐：分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌，使用时间不可超过3天）；
水性柱保存体系也不特别：
短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐），中长期保存在纯甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。
10.正相硅胶柱一般保存在什么溶剂里面比较合适？
答：短期和长期都建议保存在正相测定所用的流动相中，一般是正己烷和极少量的异丙醇。
11.多个样品不好分离的时候，请问该怎么通过选择合适的柱子来提高分离度？
答：提高分离度可从三个主要影响因素来考虑，柱效、选择性和保留因子。可通过减小填料粒径和增加柱长提高柱效；选择性和固定相选择以及pH条件有关，通过选择合适的色谱柱和合适的pH，可以提高选择性；有时候适当延长出峰时间增加保留因子，也可提高分离度。
12.我们测试样品时，经常会关心柱压是否太高，但是在购买色谱柱时，并没有说每一根色谱柱的***大使用压力是多少？针对这样的情况，用户怎么判断柱压是否超过该柱的极限？
答：装柱时的压力比使用时高很多，所以柱压对色谱柱本身在使用时没有极限问题存在，倒是一般仪器有个40Mpa的上限。如果色谱分离度还能满足分析方法要求，柱压只要仪器能承受就OK吧。
13.不知道流动相已走完，液相色谱柱空走了大概一晚上，请问这种情况下柱子还能用吗？如果可以应该如何再生？
答：能用的！可能柱子里会有气泡进去，但只要多用流动相冲冲，看到基线稳定，就没问题了。用色谱柱的保存液低流速长时间冲洗，然后，再检测一下柱效，看柱子是否恢复，液相***好设置一下***低压限，这样就不怕流动相***而会损伤色谱柱。
14.在梯度洗脱的时候，如果整个时间程序越长，保留时间的重现性越差，尤其是后出的峰重现性差更明显，怎么尽量避免这种情况的出现，使保留时间重现性更好？
答：这个要控制好环境温度和柱温，易挥发的流动相要适当密封，同时，保留时间的漂移与仪器的精度也有关系。
15.一般正常使用一个C18柱能用多长时间？
答：柱寿命一般不按时间计算，按持续进样针数比较科学。一般正常使用维护，不超过pH和温度等范围，C18柱能达到500～2000针进样的寿命，视样品干净程度的不同而不同。
16.请问怎么测柱效？（柱子填料是SinoChromODS-BP5μm，规格4.6mm×200mm）
答：测定柱效不同公司不一样，有用甲苯，也有用萘的。一般柱子里面有检测报告，你按照报告里的方法做一遍就可以。
17.峰形后拖尾是什么原因造成的？
答：[柱物理损坏]色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。***的解决方法就是更换新柱。
[柱内填料污染]流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。流动相所用的各种溶剂至少是分析纯，尽量使用色谱纯试剂。流动相所用的水***好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。用前先用0.45μm溶剂微孔过滤（器）过滤，除去可能存在的微粒。流动相建议现用现配，对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。此外还得保证储存流动相的容器清洁。复杂样品可选用0.45μm溶剂微孔过滤（器）或样品预处理柱对样品进行预处理，确保样品中不含微粒杂质。若样品不便处理，要使用保护柱。柱内填料污染时，可将柱头螺丝卸下，用专用工具挖出柱内前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修复，或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向，冲洗色谱柱（约20至30倍柱体积，或视具体情况而定；另外，此时不能接检测器），将污染物冲出色谱柱，再按色谱柱标明的使用方向使用。
[柱进口处有异物]
当断定是柱进口处有异物时，可将柱头螺丝卸下，取出滤帽并将其置于20%硝酸溶液中，用超声波清洗约20分钟，再置于超纯水中，并用超声波清洗约10分钟，重新装入色谱柱内即可。
[样品浓度过高致使柱超载]
样品在柱上超载能引起峰展宽，拖尾（或伸舌）。
适当减小进样量或样品浓度（需要时，可提高检测器灵敏度）直至峰形和保留时间不再改变，便可消除这种不良影响。减小进样量还能改善其分离度。正常情况下，样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3～50μg范围内，不会引起明显超载。
[样品溶剂不对]
选择合适的样品溶剂，以排除不必要的干扰，***好选用流动相溶解样品。
[柱外效应]
柱外效应（即，进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积）是影响色谱柱柱效的主要因素之一，所以，在可能的条件下，色谱柱的两端连接管路要尽可能短，连接管内径尽可能细小，切口务必平整光滑，尽可能的减小死体积，以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。
[缓冲不足或不合适]
在缓冲不好或离子强度过低的分离中，也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度（与样品大小相匹配）能改善此情况。
[硅醇基团作用]仔细分析色谱柱内填料表面性质可知：反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖了一半，其余的就是未被键合的硅醇基团。所谓的保留是指样品分子与键合相相互作用的结果。但是，酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质之间相互作用而引起双重保留机理，因此，发生了峰形拖尾。
为了减小峰形拖尾，通常可在流动相加入25mM三乙胺（抑制剂）。三乙胺能与硅醇基团发生强烈的相互作用，从而降低或阻断样品分子与硅醇基团的作用，以保证保留机理正常进行，并大大缓解了峰形拖尾。使用长链的硅醇基抑制剂，虽起效较慢，但，持续力较三乙胺长。因为抑制剂分子中除了胺基与硅醇基团发生极性作用外，大分子中非极性部分与固定相也会发生反相作用而产生保留现象。如果，将抑制剂加至样品中，效果会显著。
[柱内金属污染]
柱内金属污染（Fe，Ni等）可引起某引些化合物峰形拖尾。金属可由填料本身带进，也可由腐蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片，随流动相沉积到柱填料中，例如，C18柱填料被金属污染后，造成酸性/碱性样品拖尾，可用碱洗/酸洗后再键合的填料，得到的峰是尖锐且对称的。
18.哪些原因会造成色谱峰变宽、峰高变低，有哪些解决办法？
答：确实是这样，如果其它色谱条件没有改变，柱效下降是导致峰变宽的主要原因。对于易电离的极性物质，如果流动相pH选择不合适，分析物既有中性分子态存在，又有离子态存在，峰也会变宽变矮。
色谱柱使用后柱效逐步下降是正常现象，如突然降低则属异常。柱效下降原因有很多，但柱效快速下降则多半是使用不当，造成填料特性或柱床结构改变所致。如超过使用pH范围造成的固定相和硅胶基体的流失、柱床塌陷等；还有强保留物质吸附在填料表面，形成非特异性吸附层，完全改变了原有固定相的表面活性和分离性能，使柱效下降；另外进样时的压力脉冲，也会破坏柱床结构影响柱效。
参考文献来源于：制药微生物检测。
质量控制部
2019年08月02日
